2.1.6.3 试验设想准绳 （1）通过所设各组试验分析阐发，应可确定所选方式能否对测试消毒剂有优良的去除 ，对试验用微生物以及其恢复期培育能否无害或不良影响。 （2）试验中所用消毒剂的浓度应以杀菌试验中利用的最高浓度为准。不然，不脚以显示能 否将高浓度消毒剂全数去除。 （3） 统一消毒剂拟对多种微生物进行杀灭试验时，所用过滤冲刷去除法应按微生类分 别进行判定试验，不得互相代替。对细菌繁衍体的试验，可正在大肠杆菌（8099）、铜绿假单胞菌 （ATCC 15442）或金葡萄球菌（ATCC 6538）中任选其一进行试验即可；对细菌芽孢，以枯 草杆菌黑色变种（ATCC 9372）芽孢进行。 当用其他特定微生物 （如龟分枝杆菌脓肿亚种） 进行杀灭试验时，均应以该特定微生物再 次进行除药方式的判定试验。 （4）判定中应按照正式杀灭试验的设想，选择利用悬液定量试验，仍是载体定量试验太原证件制作。通 常，悬液判定试验可用于载体试验。
、上海、广州、深圳、成都、沉庆、杭州、西安、武汉、姑苏、郑州、南京、天津、长沙、东莞、宁波、佛山、合肥、青岛、昆明、沈阳、济南、无锡、厦门、福州、温州、金华、、大连、贵阳、南宁、泉州、、、南昌、惠州、常州、嘉兴、徐州、南通、太原、、珠海、中山、、、烟台、绍兴化妆品厂微生物查验员（化妆品微检员），医疗器械产物无菌查验员，卫生消毒用品无菌查验员，食物微生物查验员，约品微生物查验员，水质微生物查验员等一切涉及微生物查验的相关人员，考培及格取得微生物查验员证书；无菌微生物查验员资历证报名根基要求及收费：18-60周岁，高中及以上学历；初级（五级1800元/人）；中级（四级2000元/人）；高级（2200元/人）含材料、判定查核、证书等，及格由职业技术判定评价核心颁布微生物查验员证书，终身无效！
2.1.5.4 尝试分组 正在细菌取实菌杀灭试验中所用除药方式的判定，至多应平行进行以下各组试验。 （1）中和剂 + 菌悬液 → 培育 察看中和剂能否抑菌。 （2）（消毒剂 + 中和剂）+ 菌液 → 培育 察看中和产品，或未被完全中和的残留消毒剂对细菌有无。 （3）稀释液 + 菌悬液 → 培育 做为菌悬液阳性对照。 （4）稀释液 + 中和剂 + 培育基 → 培育 做为试验材料阳性对照。
2.1.5.8 留意事项 （1） 试验所分各组均有其特定意义，不得肆意删减。 （2） 无菌操做，连结试验用液和器材的无菌，留意改换吸管，以防止感染影响试验的 精确性。 （3） 尝试组序应按本规范所列陈列。
2.1.7.7 滤膜过滤悬液定量杀灭试验 （1）菌悬液的制备和定量杀灭试验同2.1.7.4（1）、（2）和（3）。 （2）待尝试菌取消毒剂彼此至各预按时间，别离吸收1.0ml尝试菌取消毒剂夹杂液插手 到过滤器中过滤，然后插手150至500ml冲刷液（事后置 20℃±1℃ 水浴中 5min ）做第1次冲刷 过滤处置，再插手50ml蒸馏水做第2次冲刷过滤处置，最初将滤膜有菌面朝上贴于平板概况，放 置正在37℃培育箱中培育48h。 （3）吸收0.5ml尝试菌悬液于试管内，插手0.5ml无机干扰物，再插手4.0ml尺度硬水 ，混 匀。做10倍系列稀释后 取恰当稀释度该夹杂液1.0ml插手到过滤器中，然后插手50ml蒸馏水（预 先置 20℃±1℃ 水浴中 5min ）做冲刷过滤处置，然后将滤膜有菌面朝上贴于平板概况，放置 正在37℃培育箱中培育48h，计数菌落数，做为阳性对照。 （4）别离吸收稀释液、蒸馏水和硬水各1.0ml于统一无菌平皿内，倒入上述试验同批次的培 养基15ml～20ml，放置正在37℃培育箱中培育48h，计数菌落数，做为阳性对照。 （5）试验反复 3 次 （包罗对照），计较各组的活菌量（cfu/ml或片），并换算为对数值 （N），然后按2.1.7.4（8）公式计较杀灭对数值。
2.1.7.9 留意事项 （1）正在杀菌试验中，每次均应设置阳性对照。 （2）试验中所利用的中和剂、稀释液和培育基等，各批次均应进行无菌，发觉有菌生 长，则全数试验需换用未污染试剂或培育基沉做。 （3）悬液定量杀菌试验时，无机干扰物质一般采用3.0%（W/V）牛血洁白卵白储存溶液，正在 消毒系统中稀释10倍（含量为0. 3%），进行消毒试验。若是某消毒剂利用仿单中指定，其产 品只用于洁净物品或器械的消毒或只用于冲刷浸泡消毒，可采用0.3%（W/V）牛血洁白卵白储存 溶液，正在消毒系统中稀释10倍（含量为0.03%），进行消毒试验。
2.1.7.3 尝试分组 试验中应分以下各组： （1）尝试组 按测试目标有两种选择。 第一种合用于消毒产物判定。按照利用仿单，选定尝试菌和一个消毒剂浓度（即产物利用 仿单中指定的最低浓度）以及3个时间（仿单指定最短时间，指定最短时间的 0.5倍，指定最短时间的1.5倍。如仿单指定最短时间为20min，则应进行10min、20min 和30min 3个时间）进行试验。 第二种合用于消毒产物机构日常监测。按照所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力，选定 一株抗力较强的菌和一个消毒剂浓度（即产物利用仿单中指定的最低浓度）以及1个时间 （仿单指定最短时间）进行试验。 （2）阳性对照组。按照各类试验的，用尺度硬水取代消毒剂溶液，按上述同样的步调 进行试验。所得代表菌液原有浓度，以其做为计较杀灭对数的初始浓度。
2.1.5.5 中和剂悬液定量判定试验操做法式 按照尝试分组，预备脚量试管和平皿，顺次进行编号。将菌悬液用等量适合浓度的无机干扰 物稀释成2.5×103 cfu/ml～1.5×104 cfu/ml，做为尝试菌悬液。 （1）第 1 组 取0.4ml尺度硬水于试管内，插手4.5ml中和剂,混匀，置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再插手0.1ml尝试菌悬液，混匀， 10min ，别离吸收 1.0ml，接种于两个平皿中， 做活菌培育计数。 （2）第 2 组 取0.4ml消毒剂于试管内，插手4.5ml中和剂,（对于酸性氧化电位水检测时， 取0.5ml消毒剂于试管内，插手4.4ml中和剂） 混匀，置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再插手0.1ml 尝试菌悬液，混匀， 10min ， 别离吸收 1.0ml，接种于两个平皿中，做活菌培育计数。 （3）第 3 组 取0.4ml尺度硬水于试管内，插手4.5ml稀释液,混匀，置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再插手0.1ml尝试菌悬液，混匀， 10min 证件制作联系方式，别离吸收 1.0ml，接种于两个平皿中， 17 做活菌培育计数。 （4）第 4 组 别离吸收稀释液、尺度硬水取中和剂各0.5ml于统一无菌小平皿内，倒入上述 试验同批次的培育基15ml～20ml，培育察看。如呈现细菌发展，可能提醒试验材料或操做过程中 有污染。应从头进行试验。
2.1.6.5 留意事项 （1） 试验所分各组均有其特定意义，不得肆意删减。 （2） 无菌操做，连结试验用液和器材的无菌，留意改换吸管，以防止感染影响试验的 精确性。 （3） 尝试组序应按本规范所列陈列。
2.1.5.2 尝试器材 （1）尝试菌菌悬液和菌片（见 2.1.2） （2）刻度吸管（1.0ml、5.0ml） （3）小平皿（4cm～6cm 曲径） （4）恒温水浴箱 （5）稀释液：见附录A 16 （6）培育基：见附录A （7）电动夹杂器。
（2）第4组无菌发展。不然，申明试剂有污染，应改换无污染的试剂从头进行试验。 （3）持续 3 次试验取得及格评价。
2.1.5.3 试验设想准绳 （1）通过所设各组试验分析阐发，应可确定所用中和剂能否对测试消毒剂有优良的中 和，对试验用细菌以及其恢复期培育能否无害或不良影响。 （2） 试验中所用消毒剂的浓度应以杀菌试验中利用的最高浓度为准。不然，不脚以显示能 否将高浓度消毒剂全数中和。 （3） 统一消毒剂拟对多种微生物进行杀灭试验时，所用中和剂应按微生类别离进行鉴 定试验，不得代替。对细菌繁衍体的试验，正在大肠杆菌（8099）、金葡萄球菌（ATCC 6538）、 铜绿假单胞菌（ATCC 15442）中任选其一进行试验即可；对细菌芽孢，以枯草杆菌黑色变种（ATCC 9372）芽孢进行。 当用其他特定微生物进行杀灭试验时，均应以该特定微生物进行中和剂的判定试验。 （4） 判定时按照所用杀菌试验方式，利用响应的悬液或载体定量试验。
2.1.6.1 目 的 通过滤膜过滤和冲刷的方式，去除消毒系统中的残留消毒剂，使消毒剂判定试验显示出线）过滤冲刷法需用颠末灭菌处置的滤器、微孔滤膜（孔径为0.45µ）、实空泵（或抽滤泵）。 （2）稀释液（TPS）见附录A （3）冲刷液 要求不该影响滤膜的性质，对微生物无。常用的有：水、缓冲液（如 PBS）、稀释液、0.5%吐温80的PBS、 中和剂（可中和部门消毒成分）。 （4）其他器材随所用试验微生物而定。
2.1.5.7 评价 尝试合适以下全数前提，所测中和剂可判为及格: （1） 第 1、2和3组有类似量尝试菌发展，悬液试验正在2.5×103 cfu/ml～1.5×104 cfu/ml 之间， 载体试验正在 2.5×102 cfu/片～1.5×103 cfu/片 之间。其组间菌落数误差率应不跨越 15%。第1、2和3组间菌落数误差率计较公式如下
2.1.7.6 流动浸泡载体定量杀灭试验操做法式 （1）按照2.1.2.4 制配尝试用菌片，使每个菌片的收受接管菌落数为1×106 cfu/片～5×106 cfu/ 片。 （2）臭氧水消毒设备，待发生的酸性氧化电位水或臭氧水中无效成分处于不变形态 时，进行杀灭试验。 （3）取尼龙网片或不锈钢网片放250ml烧杯底部地方，将染菌载体放于尼龙网片或不锈钢网 片概况，染菌载体上再盖一尼龙网片或不锈钢网片。将臭氧水通过管沿烧杯壁流下，流动浸泡 消毒至时间，用无菌镊子将染菌载体取出别离移入一含 5.0ml 中和剂试管中。用电动 夹杂器夹杂20s或将试管正在手掌上振敲 80 次，使菌片上的细菌被洗脱进入中和液中，再放置5min 以上，使中和充实。最终进一步混匀后，吸收 1.0ml 间接接种平皿，每管接种 2 个平皿， 做为尝试组样本。 （4）另取两个染菌载体放入250ml烧杯中，放置方式取尝试组不异。以自来水取代臭氧水， 正在不异流量动浸泡至最长时间，其余步调取尝试组不异，做为阳性对照组样本。 （5）别离吸收稀释液取中和剂各1.0ml于统一无菌平皿内，倒入上述试验同批次的培育基 15ml～20ml，做为阳性对照样本。 （6）所有试验样本均正在 37℃（黑曲霉菌正在30℃） 培育箱中培育，对细菌繁衍体培育48h 不雅 23 察最终；对线h 察看最终。 （7）试验反复 3 次 （包罗对照），计较各组的活菌量（cfu/片），并换算为对数值（N）， 然后按2.1.7.4（8）公式计较杀灭对数值：杀灭对数值 （KL）＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）－尝试组活菌浓度对数值（Nx）。
2.1.6.4 过滤冲刷去除方式的判定 （1）分组方式如下： 第1 组（菌悬液 + 水） ＋过滤冲刷处置 → 培育 察看除药处置能否影响尝试菌的发展数量。 第2 组 菌悬液→过滤+过滤冲刷 → 培育 过滤的影响 19 第3 组干扰物+稀释液+消毒剂→过滤+冲刷过滤+菌悬液→过滤+冲刷过滤→培育 消毒剂、无机干扰物对过滤冲刷法的影响 （2）操做法式如下： 按照尝试分组，预备脚量试管和平皿，顺次进行编号。将菌悬液用等量适合浓度的无机干扰 物稀释成2.5×102 cfu/ml～1.0×103 cfu/ml，做为尝试菌悬液。 1） 第 1 组 吸收1.0ml尝试菌悬液于试管内， 插手4.0ml尺度硬水 ，混匀。 取 1.0ml 插手到过滤器中，然后插手50ml蒸馏水（事后置 20℃±1℃ 水浴中 5min ）做冲刷过滤处置， 然后间接将滤膜有菌面朝上贴于平板概况，放置正在37℃培育箱中培育48h，计数菌落数。 2） 第 2 组 吸收0.2ml尝试菌悬液间接插手到过滤器中，然后插手150ml至500ml冲刷液（预 先置 20℃±1℃ 水浴中 5min ）于过滤器中，做第1次冲刷过滤处置，再插手50ml蒸馏水做第2 次冲刷过滤处置，最初将滤膜有菌面朝上贴于平板概况，放置正在37℃培育箱中培育48h（线ml消毒剂于试管中，插手0.5ml无机干扰物，再插手0.5ml稀释液，混匀， 取 1.0ml插手到过滤器中，插手150至500ml冲刷液（事后置 20℃±1℃ 水浴中 5min ）做第1 次冲刷过滤处置，再插手50ml冲刷液做第2次冲刷过滤处置,冲刷后吸收0.2ml尝试菌悬液间接加 入到过滤器中, 再插手50ml蒸馏水做第3次冲刷过滤处置,然后将滤膜有菌面朝上贴于平板概况， 放置正在37℃培育箱中培育48h（线h），计数菌落数。 （3） 评价 试验合适以下全数前提，所测中和剂可判为及格: 1） 第 1、2 和3 组测定的，微生物数量应正在 2.5×102 cfu/ml～1×103 cfu/ml 之间， 其组间差不得跨越3组收受接管菌数平均值的15%。组间差的计较可按下式进行。
2.1.7.1 目 的 正在尝试室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上细菌繁衍体和细菌芽孢所需剂量，以验证明用消 毒剂量。
2.1.7.5 载体浸泡杀菌试验操做法式 （1）载体浸泡定量杀菌试验操做法式 1）按照2.1.2.4 制配尝试用菌片，使每个菌片的收受接管菌落数为1×106 cfu/片～5×106 cfu/ 片。 2）取无菌小平皿，标明所注入消毒液的浓度。按每片 5.0ml 的量，吸收响应浓度的消毒剂 溶液注入平皿中。 3）将盛有消毒剂平皿置 20℃±1℃ 水浴箱内 5min 后，用无菌镊子别离放入事后制备的菌 片 3 片，并使之淹没于消毒液中。 4）待菌药彼此至各预按时间，用无菌镊子将菌片取出别离移入一含 5.0ml 中和剂试管 中。用电动夹杂器夹杂20s，或将试管正在手掌上振敲 80 次，使菌片上的细菌被洗脱进入中和液 中，再放置5min以上，使中和充实。最终进一步混匀后，吸收 1.0ml 间接接种平皿，每管 接种 2 个平皿，测定存活菌数。 5）另取一平皿，注入 10.0ml 稀释液取代消毒液，放入 2 片菌片，做为阳性对照组。其随 后的试验步调和活菌培育计数取上述尝试组不异。 6）所有试验样本均正在 37℃ 温箱中培育，对细菌繁衍体培育48h 察看最终；对细菌芽 孢需培育 72h 察看最终。 7）试验反复 3 次 （包罗对照），计较各组的活菌量（cfu/片），并换算为对数值（N）， 22 然后按2.1.7.4（8）公式计较杀灭对数值。 （2）载体浸泡定性灭菌试验操做法式 1）按照2.1.2.4 制配尝试用菌片，使每个菌片的收受接管菌落数为1×106 cfu/片～5×106 cfu/ 片。 2）取无菌小平皿，标明所注入消毒液的浓度。按每片5.0ml的量，吸收响应浓度的消毒剂溶 液注入平皿中。 3）将盛有消毒剂平皿置20℃±1℃水浴箱内5min后，用无菌镊子别离放入事后制备的菌片6 片，（每个时间2片菌片）并使之淹没于消毒液中。 4）待尝试菌取消毒液彼此至各预按时间，用无菌镊子将菌片取出别离移入一含5.0ml 中和剂TSB试管中。用电动夹杂器夹杂20s，做为尝试组样本。 5）另取一平皿，注入20.0ml尺度硬水取代消毒液，放入4片菌片，至预按时间，取出2 片，别离移入含5ml中和剂TSB试管中。其随后的试验步调取上述尝试组不异，做为阳性对照组样 本。另取出2片，别离移入一含5.0ml中和剂试管中，用电动夹杂器夹杂20s，或将试管正在手掌上 振敲80次，然后用稀释液做10倍系列稀释，选择适宜稀释度，吸收1.0ml接种平皿，每管接种2 个平皿，做活菌培育计数，做为菌数对照组样本。 6）所有试验样本均正在37℃温箱中培育，对细菌繁衍体培育48h，察看最终；对细菌芽孢 需培育7d，察看最终。 7）试验反复5次（包罗对照），计较各组的活菌量（cfu/片）。
2.1.7.2 尝试器材 （1）按 2.1.2 所示方式制备的金葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和枯草杆菌黑色 变种芽孢悬液或菌片。此外，按照消毒剂特定用处或试验特殊需要，预备其他菌种的悬液或菌片。 （2）消毒剂溶液除有特殊者外，应利用无菌硬水配制。消毒剂溶液浓度应以所含无效 20 成份为准。例如，含氯消毒剂以所含无效氯浓度为准，碘伏以所含无效碘为准，过氧乙酸以所含 过氧乙酸量为准，复方消毒剂浓度以次要杀菌无效成分含量为准。各组消毒剂溶液无效成份浓度 的计较，应以尝试菌取消毒剂的夹杂液中无效成份的最终浓度为准。 （3）去除残留消毒剂的中和剂或设备（经判定试验证明及格的中和剂或相关器材）。 （4）消毒剂稀释用尺度硬水：见附录A。 （5）无机干扰物质。悬液试验和载体试验用牛血洁白卵白溶液，本规范中利用 3.0% 牛血洁白卵白，代表一般污染对象上可能存正在的无机物程度；0.3%牛血洁白卵白，代表先经洁净 操做，然后进行消毒处置的对象上可能存正在的无机物程度、或持续冲刷消毒的物品上污染的无机 物程度。 无机干扰物的设置装备摆设方式见附录A。 （6）TSA培育基：见附录A （7）含中和剂的胰卵白胨大豆肉汤培育基（中和剂TSB），中和剂经判定及格。 （8）刻度吸管 （1.0ml、5.0ml） （9）恒温水浴箱 （10电动夹杂器 （11）秒表。
2.1.7.4 悬液定量杀菌试验操做法式 （1）按照2.1.2 配制尝试用菌悬液，使其浓度为1×108 cfu/ml～5×108 cfu/ml（收受接管菌落数 为1×107 cfu/ml～5×107 cfu/ml）。 （2）按照产物仿单要求配制消毒液。无特殊申明者，一律利用无菌硬水配制，配制的 浓度为待测浓度的 1.25 倍（例如要评价的消毒液浓度为 200mg/L，则应配制 250mg/L），置 20℃±1℃ 水浴备用。 （3）打消毒试验用无菌大试管，先插手0.5ml试验用菌悬液，再插手0.5ml无机干扰物质， 21 混匀，置 20℃±1℃ 水浴中 5min后，用无菌吸管吸收上述浓度消毒液 4.0ml 注入此中，敏捷 混匀并当即记时。 （4）待尝试菌取消毒剂彼此至各预按时间，别离吸收0.5ml尝试菌取消毒剂夹杂液加于 4.5ml 经灭菌的中和剂中，混匀。 （5）各管尝试菌取消毒剂夹杂液经加中和剂 10min 后，别离吸收 1.0ml样液，按活菌 培育计数方式测定存活菌数，每管样液接种 2 个平皿即可。如平板上发展的菌落数较多时，可 进行系列10倍稀释后，再进行活菌培育计数。 （6）同时用尺度硬水取代消毒液，进行平行试验，做为阳性对照。 （7）所有试验样本均正在 37℃ 温箱中培育，对细菌繁衍体培育48h 察看最终；对细菌 芽孢需培育 72h 察看最终。 （8）试验反复3次，计较各组的活菌浓度（cfu/ml），并换算为对数值（N），然后按下式 计较杀灭对数值: 杀灭对数值 （KL）＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）－尝试组活菌浓度对数值（Nx） 计较杀灭对数值时，取小数点后两位值，能够进行数字修约。可是，若是消毒尝试组消毒处 理后平均发展菌落数小于1时，本规范此时的杀灭对数值，即大于等于对照组平均活菌浓度 的对数值。即KL≥Log（No）。
2.1.7.8 评价 （1）产物查验，正在产物仿单指定的最低浓度取最短时间，反复试验3次。要求悬 液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值均≥5.00，可鉴定为消毒及格。要求载体定量杀灭试验， 各次的杀灭对数值均≥3.00，可鉴定消毒及格。 （2）产物申报卫生许可查验中，要求正在产物仿单指定的浓度取3时间，反复试验3次。 正在产物指定最低浓度取最短时间，以及最短时间的1.5倍时，要求悬液定量杀灭试验中 各次的杀灭对数均应≥5.00。要求载体定量杀灭试验和流动浸泡载体定量杀灭试验中，各次的杀 灭对数均应≥3.00，可鉴定为消毒及格。正在产物指定浓度取最短时间的0.5倍时，可容许对 分歧细菌或正在部门反复次数中，呈现不及格。查验机构若是发觉产物仿单指定的浓度取时间，取常规消毒 剂量差别较大，不克不及进行消毒试验评价时，可按照专业学问合理调整其浓度取时间，然后再进行 测试。 （3）对载体浸泡定性灭菌试验，阳性对照组应有菌发展，菌数对照组合适要求，阳性对照 组应无菌发展，5 次试验所有时间均无菌发展为灭菌及格。 （4）中应将各次试验的全数以表格的形式列出。阳性对照组应列出各次尝试菌浓 度，以及平均尝试菌浓度。尝试组应列出杀灭对数值，杀灭对数值大于5.00时，应暗示为≥5.00， 而不必列出具体的数字；杀灭对数值小于5.00时，应列出具体的数字（例如2.58，4.65）。
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